實驗概要
運用LOWRY法測定蛋白質(zhì)的含量。
實驗原理
Lowry法是雙縮脲法和福林酚法的結(jié)合與發(fā)展,其原理是:蛋白質(zhì)溶液用堿性銅溶液處理,形成銅-蛋白質(zhì)的絡(luò)合鹽,再加入酚試劑后,除使肽鏈中酪an氨酸、色氨an酸和半胱氨an酸等顯色外,還使雙縮脲法中肽鍵、堿性銅的顯色效果更強烈。因此,Lowry法的顯色效果比單獨使用酚試劑強烈3~15倍,為雙縮脲法100倍。由于肽鍵顯色效果增強,從而減小了因蛋白質(zhì)種類引起的偏差。
Lowry法的試劑由兩部分組成,試劑甲相當(dāng)于雙縮脲試劑(堿性銅溶液),可與蛋白質(zhì)中的肽鍵起顯色反應(yīng);試劑乙為磷鎢酸和磷鉬酸混合液,在堿性條件下極不穩(wěn)定,易被酚類化合物還原生成鉬藍和鎢藍混合物而呈藍色反應(yīng),因此蛋白質(zhì)的酪an氨酸和胱an氨酸等可顯色,顏色深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。
主要試劑
Na2WO4•2H2O;Na2MoO4•2H2O;85% H3PO4;濃HCl;Li2SO4•H2O;溴水;酚fen酞指示劑;Na2CO3;NaOH;CuSO4•5H2O;酒石酸鉀鈉;
牛血清白蛋白:用水配成250mg/ml。
主要設(shè)備
試管若干;刻度吸管0.5ml,1ml,10ml;定量加樣器;圓底燒瓶;冷凝管一套(帶橡膠管);微量滴定管;小燒杯;微量進樣器50μl;分光光度計。
實驗材料
可溶性蛋白質(zhì)
實驗步驟
1. 酚試劑的制備
(1)取Na2WO4•2H2O 100g,Na2MoO4•2H2O 25g 及蒸餾水700ml于1500ml的圓底燒瓶中,之后加入85% H3PO4 50ml,濃HCl 100ml。安上回流冷卻裝置(使用磨口接頭。用軟木塞或橡皮塞時,必須用錫泊包起來),使其慢慢沸騰10h。冷卻后加入Li2SO4•H2O 150g,水50ml,濃HCl 100ml安上回流冷卻裝置,開口加熱煮沸15min,以逐出過量的溴。冷卻后稀釋至100ml,并過濾入棕色瓶中,密閉于冰箱中保存。
使用時用標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定,以酚fen酞為指示劑。滴定終點由藍變灰。滴定后算出酸濃度,用時適量稀釋,使最后濃度為1mol/L H+,此為Folin-酚試劑乙液。
(2)首先配制①4% Na2CO3溶液;②0.2mol/L NaOH溶液;③1% CuSO4溶液;④2%酒后石酸鉀鈉溶液;使用前①與②等體積混合配成Na2CO3-NaOH溶液;將③與④等體積混合配成硫酸銅一酒石酸鉀鈉溶液。然后將這兩個溶液按50︰1混合;配成Folin-酚試劑甲液。此試劑只能用一天。
2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
(1)取7只試管編號,分別加0ml,0.1ml,0.2ml,0.4ml,O.6ml,0.8ml,1.0ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液,用水補到1ml,便成為每管含蛋白為0mg,25mg,50mg,100mg,150mg,200mg,250mg標(biāo)準(zhǔn)系列(必要時可做重復(fù))。
(2)加5ml試劑甲,混勻,于30℃放置10min。
(3)噴射加入0.5ml試劑乙,立即振蕩混勻,在30℃下保溫30min。
(4)準(zhǔn)確到30分后,以不加標(biāo)準(zhǔn)蛋白的管為空白,在500nm波長下比色測定吸光度值。
(5)以蛋白濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3. 樣品測定
(1)取50μl樣液加入試管中,(樣液提取一般按0.1g鮮樣/ml比例,提取方法見各酶活測定)加蒸餾水補至1ml,然后重復(fù)步驟2的(2),(3),(4),以空白為參比,測吸光度值。
(2)根據(jù)吸光度值,查標(biāo)準(zhǔn)曲線求得蛋白質(zhì)含量。
4. 結(jié)果計算
蛋白質(zhì)含量(mg/g鮮重)= (C*V/a)/W 式中 C-查標(biāo)準(zhǔn)曲線得樣品測定管中蛋白質(zhì)含量(mg);
V-提取液總量(ml);
a-測定時取樣液量(ml);
W-取樣量(g)。
注意事項
1. Folin試劑乙只在酸性條件穩(wěn)定,故當(dāng)其加到堿性的銅-蛋白質(zhì)溶液中時,必須立即混勻,以便在磷鉬酸-磷鎢酸試劑被破壞前,還原反應(yīng)即能發(fā)生。
2. 為了保證反應(yīng)進行完wan全,反應(yīng)在25~30℃水浴中進行,反應(yīng)30min后準(zhǔn)時比色。
3. 還原物質(zhì)干擾本實驗。
考馬斯亮藍法和LOWRY法兩種方法均是靈敏度為微克級的高靈敏度定量測定蛋白質(zhì)方法,前者穩(wěn)定,后者簡便;二者均優(yōu)于現(xiàn)有的其它方法。
二者的缺點是:
1. Lowry法受植物體內(nèi)存在的酚類物質(zhì)干擾;
2. 考馬斯亮藍法在蛋白質(zhì)含量很高時線性關(guān)系稍偏低,且不同蛋白質(zhì)與色素結(jié)合狀況有差異。