WB免疫印跡法,也稱免疫轉(zhuǎn)移技術(shù)IBT(Immunoblotting),是Towbin將1975年Southern發(fā)明的Soutnern blotting技術(shù)應(yīng)用于蛋白-蛋白相互作用建立的免疫學(xué)檢測(cè)方法。其操作簡便,主要用于未知蛋白檢測(cè)及抗原組分、抗原決定簇鑒定,同時(shí)也用于未知抗體的檢測(cè)和單抗鑒定等,在生物學(xué)基礎(chǔ)研究和臨床疾病早期診斷和預(yù)后跟蹤分析方面都有應(yīng)用。
WB實(shí)驗(yàn)中使用到的有三種抗體:一抗、二抗和內(nèi)參抗體。一抗是唯1針對(duì)目標(biāo)抗原的抗體,可以進(jìn)行制備也可以購買現(xiàn)貨,難度系數(shù)較高;二抗直接買就OK,只是需要留意下種屬選擇;內(nèi)參抗體必bi不可少,是WB實(shí)驗(yàn)中的質(zhì)控環(huán)節(jié)。
那么,在制備抗體或者選擇抗體時(shí),是不是十分糾結(jié)?今天,遠(yuǎn)慕跟大家聊一聊。
WB檢測(cè)之一抗
一抗制備
如果目的蛋白的現(xiàn)貨抗體沒有找到,或者都不中意,就需要親自動(dòng)手制備了,請(qǐng)公司幫你做也不錯(cuò)哦!自己制備一抗通常情況下可以選小鼠、兔制備多抗或者選小鼠制備單抗,前者省時(shí)省錢,后者耗時(shí)耗財(cái)卻各有優(yōu)缺點(diǎn)。多抗制備出來容易產(chǎn)生雜帶,卻容易出結(jié)果,單抗制備出來能得到單一條帶及一張漂亮的WB圖片,拿去炫耀下也不錯(cuò)。然而做單抗如果沒有強(qiáng)有力的細(xì)胞培養(yǎng)、融合、篩選經(jīng)驗(yàn),也有各種意想不到的結(jié)果。比如完敗,或者只篩到一株卻不能做WB。不過在每一步實(shí)驗(yàn)中注意細(xì)節(jié)還是可以得到滿意的抗體的。
多抗制備過程:
第一步:免疫及效價(jià)檢測(cè)??此浦皇前芽乖蜻M(jìn)動(dòng)物體內(nèi),其實(shí)暗藏玄ji機(jī),不同的免疫方式效果不一。通常情況下,免疫效果排序如下:皮內(nèi)>皮下>腹腔>靜脈,通常采用皮內(nèi)或皮下免疫。免疫劑量過多過少均會(huì)產(chǎn)生免疫耐受,一般小鼠每次每只免疫50 μg共4次,兔每次每只免疫300-500 μg共5次。每次免疫后測(cè)定效價(jià)均要設(shè)置對(duì)照,以排除各種情況導(dǎo)致的ELISA假陽性或假陰性。
第二步:取血。小鼠取血通常采用眼球取血,一只小鼠可得到大約1.5 mL的抗血清。兔取血通常采用頸動(dòng)脈取血,一只兔可得到大約25 mL的抗血清。
第三步:抗體純化。單抗的純化使用proteinA/G即可,得到的都是均一性的抗體分子。多抗的純化可以采用proteinA/G或抗原親和純化,后者篩掉了一些非特異性的IgG,留下的都是能與抗原結(jié)合的抗體,所以能在一定程度上避免WB結(jié)果的雜帶問題。
單抗制備過程:
第一步:參照多抗制備的第一步。
第二步:細(xì)胞融合。細(xì)胞在融合的過程中非常脆弱,所以勁道要輕、時(shí)間要把控好,一般按照標(biāo)準(zhǔn)的融合方案來,做到能一手畫圓一手畫圈,此步需要向郭靖童鞋學(xué)習(xí),手不要抖則基本達(dá)標(biāo),可以在融合板里看到很多圓溜溜的單克隆。
第三步:亞克隆?;旧铣绦蚧僮?,對(duì)細(xì)胞吹打不要太狠就行。
第四步:篩選檢測(cè)。細(xì)胞融合及亞克隆后都要對(duì)細(xì)胞上清進(jìn)行篩選檢測(cè)。細(xì)胞單克隆在生長過程中容易因?yàn)橥饬ι⒙涑刹灰?guī)則形狀而影響判斷,或許一個(gè)很好的陽性克隆就這么被忽略掉了。所以千萬不要讓你的板子磕到了,尤其是融合的細(xì)胞板換液時(shí)更是要極其小心。當(dāng)然,如果不嫌麻煩可以把融合板的單克隆挑到新的細(xì)胞板再進(jìn)行檢測(cè)。
第五步:腹水制備。將篩選的陽性單抗細(xì)胞株注射到小鼠腹腔,經(jīng)過一段時(shí)間小鼠腹腔會(huì)產(chǎn)生含高濃度單抗的腹水。注射的細(xì)胞數(shù)量不宜過多或過少,過少會(huì)導(dǎo)致不生成腹水或周期過長,過多會(huì)導(dǎo)致小鼠過早死亡。一般一只小鼠腹腔注射10^6個(gè)細(xì)胞即可,大約2周即可取腹水。
第六步:參照多抗制備的第三步。
一抗選擇
如果有現(xiàn)貨,就不用花時(shí)間精力再去自己制備啦,快來get現(xiàn)貨一抗選擇新技能!
①抗體的說明書中明確指明可用于WB檢測(cè)的是shou選。但沒寫不表示不能做,可能廠商沒有驗(yàn)證,如果確實(shí)需要這個(gè)或者只有這一個(gè),可以向廠商申請(qǐng)?jiān)囉醚b哦。
②抗體適用的種屬也是需要考慮的。說明書中也會(huì)寫明,如果研究樣本的來源物種不在列表里,也并不代表就不能使用,不過最好不用。當(dāng)然抗體的適用性與不同物種統(tǒng)一蛋白的序列相似性有關(guān),用信息學(xué)的方法比對(duì)一下可以預(yù)測(cè)抗體是否可用,如果同源性較高的話還是可以選擇的。
③抗原類型也需要審視。免疫原不限于蛋白,菌體或細(xì)胞都可以作為免疫原,在選擇時(shí)要進(jìn)行區(qū)分。比如要檢測(cè)的是蛋白的區(qū)段或同型物,就要選擇用含此片段域的免疫原制備出的抗體。
④如果一抗是未標(biāo)記的,后續(xù)還需使用二抗,則選擇的一抗來源物種與樣本來源物種要避免相同導(dǎo)致交叉反應(yīng)。比如檢測(cè)大鼠組織內(nèi)目的蛋白,則最好選兔抗鼠的一抗,而不選擇小鼠來源的一抗。如果一抗是標(biāo)記的,則可以不考慮這個(gè)問題。
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