相信屏幕前的你,可能被 shRNA 干擾實驗困擾了無數(shù)個日日夜夜......
亦或是屢屢想嘗試,卻次次與之失之交臂......
......被困擾的你是跪在哪一步了呢?
......而止步于起點的你又是因為什么呢?
今天寫作這篇文章的目的呢,正是為幫助做實驗的你縷清思路。讓在干擾實驗門口「探頭」的你,系統(tǒng)的了解整個流程,從而讓入門不再只是想象。
下面我要開始放大招了:
(一)shRNA 干擾機制&shRNA 設(shè)計
shRNA(short/ small hairpin RNA)干擾機制圖解
shRNA 組成:
shRNA 包括兩個短的反向互補序列,中間由莖環(huán)(loop)序列分隔,組成發(fā)夾結(jié)構(gòu),隨后連上 5~6 個 T(轉(zhuǎn)錄終止信號)
手動設(shè)計,原則:
A. 首先靶位點選擇應(yīng)該避開基因的非編碼區(qū);
B. 在正義鏈和反義鏈序列上不能出現(xiàn)連續(xù) 3 個或以上的 T,這可能導(dǎo)致 shRNA 轉(zhuǎn)錄的提前終止;
C. Stratagene 發(fā)現(xiàn) 29 個寡核苷酸抑制目的基因表達的效率比 23 個寡核苷酸的高;
D. 在啟動子下游的酶切位點下方緊連一個 C,使插入片段和啟動子有一定空間間隔以確保轉(zhuǎn)錄的發(fā)生;
E. shRNA 目的序列的個堿基必須是 G 以確保 RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄。如果選擇的目的序列不以 G 開頭,必須在緊連正義鏈的上游加一個 G;
F. shRNA 插入片段中的莖環(huán)應(yīng)當(dāng)靠近寡核苷酸的中央,比較了眾多不同長度和序列的莖環(huán),5'TTCAAGAGA3' 序列zui為有效;
G. 5~6 個 T 必須放置在 shRNA 插入片段尾部以確保 RNA 聚合酶III終止轉(zhuǎn)錄;
shRNA 設(shè)計好并合成之后,通過同源重組或者是酶切連接的方法進行干擾載體構(gòu)建,構(gòu)建成功后大量抽提質(zhì)粒(去內(nèi)毒素且 OD260/OD280 hao在 1.8 左右),以備轉(zhuǎn)染。