慢病毒(Lentivirus)載體是以人類免疫缺陷I型病毒為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體,它對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力。在轉(zhuǎn)染遺傳物質(zhì)到細(xì)胞基因組中的工作中,重組慢病毒載體是一個(gè)強(qiáng)大和有效的工具,該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上,從而達(dá)到持久性表達(dá)。在感染能力方面可有效地感染包括幾乎所有的哺乳動(dòng)物細(xì)胞、干細(xì)胞和原代培養(yǎng)的細(xì)胞,目前慢病毒系統(tǒng)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用到各種細(xì)胞系的基因過表達(dá)、RNA干擾、microRNA研究以及活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中,從而達(dá)到良好的的基因治療效果,在美國已經(jīng)開展了臨床研究,效果非常理想,因此具有廣闊的應(yīng)用前景。
慢病毒轉(zhuǎn)染優(yōu)點(diǎn):
1.外源基因表達(dá)水平較高、表達(dá)穩(wěn)定;
2.轉(zhuǎn)染效率高,可感染分裂和不分裂的細(xì)胞,幾乎可以感染所有類型的細(xì)胞,特別適合質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染效率低的細(xì)胞;
3.慢病毒基因容易操作,易于制備大量病毒且滴度高;
4.病毒基因組可整合到細(xì)胞基因組,易于構(gòu)建穩(wěn)定細(xì)胞株。
慢病毒包裝技術(shù)
慢病毒表達(dá)載體包含了包裝、轉(zhuǎn)染、穩(wěn)定整合所需要的遺傳信息。將外源基因克隆進(jìn)入表達(dá)載體,同時(shí)與包裝質(zhì)粒(表達(dá)病毒包裝所需輔助蛋白)一起轉(zhuǎn)染細(xì)胞,在細(xì)胞中進(jìn)行病毒的包裝,包裝好的假病毒顆粒分泌到細(xì)胞外的培養(yǎng)基中,收取培養(yǎng)基離心后可直接用于感染宿主細(xì)胞,當(dāng)目的基因進(jìn)入細(xì)胞后被整合到宿主基因組,從而表達(dá)目的基因。
方法一:超速離心沉淀法
1. 取6個(gè)Ultra-clear SW28離心管,用70%乙醇消毒后,放在超凈工作臺(tái)中打開紫外燈繼續(xù)消毒30分鐘。
2. 每個(gè)Ultra-clear SW28離心管中加入約32ml的預(yù)先處理的病毒上清液。
3. 取一支10ml的移液管,吸取12 ml 20%的蔗糖溶液。將移液管一直插入到離心管的底部,緩慢將蔗糖溶液打出4 ml。同樣地,將剩下8 ml的蔗糖溶液分別加入到另兩個(gè)離心管中。另取一支干凈的移液管,對剩下3管進(jìn)行同樣處理。
4. 用PBS調(diào)整各管的重量,使對應(yīng)的離心管之間的重量相差不超過0.1g。
5. 按次序?qū)⑺?個(gè)離心管放入Beckman SW28 超速離心轉(zhuǎn)頭中。
6. 4℃,25,000 rpm. (82,700g) 離心2小時(shí)。
7. 小心將管子從轉(zhuǎn)頭中取出。倒掉上清,將離心管倒扣在紙巾上放置10分鐘使剩余的上清流干。吸掉剩余的液滴。在管底應(yīng)當(dāng)有可見的沉淀。
8. 每管中加入100ml 不含鈣和鎂的PBS洗下沉淀。
9. 將SW28超速離心管插入到50ml錐底離心管中,蓋上蓋子。
10. 在4℃溶解2小時(shí),每隔20分鐘輕輕震蕩。
11. 4℃,500g離心1分鐘,使溶液集中于管底。
12. 用200μl 移液器輕柔吹打使沉淀重懸。避免產(chǎn)生泡沫。將所有管中的液體集中到一個(gè)SW28離心管中。
13. 集中后的病毒懸液分裝成50μl 每份,保存在成品管中。用碎干冰速凍后儲(chǔ)存在-80 ℃。
方法二:依科賽慢病毒濃縮液
1. 收集上清液,3000×g離心15分鐘清除細(xì)胞和細(xì)胞碎片。
2. 將上清液轉(zhuǎn)移至無菌容器中,向4V的病毒上清液中加入1V的病毒濃縮液,4°C 孵育過夜(至少12小時(shí))。
3. 混合液1500×g離心 30分鐘,在容器的底部可能會(huì)出現(xiàn)為米色或白色沉淀。
4. 吸上清,1500×g離心5分鐘,吸液去除所有的殘留液體,同時(shí)特別注意不要破壞已沉淀的病毒顆粒。
5. 用1/10 -1/100體積冷的,無菌PBS緩沖液或DMEM(含25mM HEPES緩沖液)在4℃條件下重懸病毒沉淀。
6. 分裝在預(yù)冷的小瓶中,-70℃儲(chǔ)存,直到使用。