加、減、換一個(gè)載體 的MCS的位點(diǎn) （給一個(gè)表達(dá) 載體加、減、換小表達(dá)標(biāo)簽，如His6， His10，strep II等，和MCS改造是一樣的），其實(shí)技術(shù) 不是問(wèn)題，問(wèn)題在于位點(diǎn)的選擇 ，因?yàn)檩d體設(shè)計(jì) 時(shí)應(yīng)該設(shè)計(jì)者也考慮過(guò)mcs的問(wèn)題，應(yīng)該給使用者越多的選擇越好，但為什么有的載體只給有限的幾個(gè)位點(diǎn)呢，一可能是這個(gè)載體其他部位本身含有的限制性切點(diǎn)比較多，因而MCS位置的選擇比較少，二就是設(shè)計(jì)者是自用的載體，沒(méi)有考慮到我們的感受 。
因此如果你要加、減、換MCS，可以按一下幾個(gè)步驟進(jìn)行：
1、找到載體全序列 ，查找有沒(méi)有你想要加的位點(diǎn)（Primer premier5……一堆軟件 ，再不濟(jì)了用word），如果沒(méi)找到你想加、減、換的位點(diǎn)，恭喜了，革命要成功了；
2、方法上不太推薦點(diǎn)突變或其他以overlap PCR 為基礎(chǔ)的技術(shù)，推薦小片段 克隆 ，也就是做shRNA 載體的那種方法，人工合成（按引物 合成）你想要的MCS序列的正反鏈，兩端加上載體上兩個(gè)切點(diǎn)的粘末端序列，人工退火（95度10min，然后每分鐘降5度直至Tm值下5度，維持10min，即可），不用電泳檢驗(yàn)，直接按克隆的連接體系將這個(gè)小片段與你的載體（相應(yīng)酶雙切）連接轉(zhuǎn)化……
小片段連入的效率相當(dāng)高，如果大家要檢驗(yàn)：在菌長(zhǎng)出來(lái)后，做PCR檢驗(yàn)（人工合成的這個(gè)小片段的正鏈或反鏈與載體上的引物）。舉個(gè)例子：
比如要在某載體的EcoR I和BamH I之間加一個(gè)新的MCS（EcoR V－Kpn I－Xho I－Hind III）（這幾個(gè)位點(diǎn)必須在目的 載體上沒(méi)有，如果有這個(gè)切點(diǎn)，你又實(shí)在想用的話，可以將目的載體用這個(gè)酶單切，綠豆芽核酸 酶/s1核酸酶平端化，再自連——位點(diǎn)封閉）：
1、合成 5‘－AATTC GATATC NNN GGTACC NNN CTCGAG NNN AAGCTT G-3'3'－G CTATAG NNN CCATGG NNN GAGCTC NNN TTCGAA CC TA G-5'
EcoR I粘末端 EcoRV Kpn I Xho I Hind III BamH I粘末端 ； （這里面有幾個(gè)要點(diǎn)，合成時(shí)直接合成粘末端，省得再切，這樣既省合成的錢，效率又高，如果你需要在改造后的載體繼續(xù)使用原載體的連入切點(diǎn)，比如上面例子的EcoR I和BamH I，你像例子中一樣可以合成完整的酶切位點(diǎn)粘末端，如果你不想使用它們，那就只合成粘末端，比如上面那個(gè)例子，應(yīng)合成5-AATT GATATC ……和3’-CTATAG ……這樣連接后，EcoR I切點(diǎn)就被封閉了；再有要注意考慮連入位點(diǎn)之間要留一定的間隔，因?yàn)榭恐膬蓚€(gè)酶是很難雙切開(kāi)的，有時(shí)候分步切都沒(méi)用，因?yàn)榱艚o酶結(jié)合的空間太小，沒(méi)法結(jié)合l ，一般按照相鄰兩個(gè)酶的推薦保護(hù)堿基數(shù)中較大的數(shù)目留，*啊）
2、退火，如上；
3、克隆，同上；
4、檢驗(yàn)，同上。測(cè)序，收工。
突變可以考慮，但如果載體太長(zhǎng)了，做點(diǎn)突變?cè)讲蝗菀祝环矫姹容^難延伸，另一方面，即使延伸了，其他點(diǎn)突變的幾率也會(huì)比較大，但誰(shuí)知道呢？有時(shí)候要靠一點(diǎn)運(yùn)氣。如果想突變也是可以。
?
