DNA是所有生物體的基本組成物質(zhì)
DNA是所有生物體的基本組成物質(zhì)。DNA主要存在于細(xì)胞核中。制備DNA時應(yīng)將細(xì)胞核膜打破方能釋放出來,上海遠(yuǎn)慕詳述:
細(xì)胞中的DNA和RNA分別與蛋白質(zhì)相結(jié)合,形成脫氧核糖核蛋白及核糖核蛋白。在細(xì)胞破碎后,這兩種核蛋白將混雜在一起。因此,要制備DNA首先要將這兩種核蛋白分開。已知這兩種核蛋白在不同濃度的鹽溶液中具有不同的溶解度,如在0.15mol/LNaC1的稀鹽溶液中核糖核蛋白的溶解度,脫氧核糖核蛋白的溶解度則zui?。▋H約為在純水中的1%);而在lmol/LNaCl的濃鹽溶液中,脫氧核糖核蛋白的溶解度增大,至少是在純水中的2倍,核糖核蛋白的溶解度則明顯降低。根據(jù)這種特性,調(diào)整鹽濃度即可把這兩種核蛋白分開。因此,在細(xì)胞破碎后,用稀鹽溶液,反復(fù)清洗,所得沉淀即為脫氧核糖核蛋白成分。
分離得到的脫氧核糖核蛋白,用十二烷基硫酸鈉(SDS)使蛋白質(zhì)成分變性,讓DNA游離出來,再用含有異戊醇的沉淀除去變性蛋白質(zhì)。zui后根據(jù)核酸只溶于水而不溶于有機(jī)溶劑的特點,加入95%的乙醇即可從除去蛋白質(zhì)的溶液中把DNA沉淀出來,獲得產(chǎn)品。
當(dāng)細(xì)胞破碎時,細(xì)胞內(nèi)的脫氧核糖核酸酶(DNase)立即開始降解DNA,如果在破碎細(xì)胞后不及時采取抑制酶活的措施,zui后將會得不到任何DNA。為此,如在本實驗中加入檸檬酸鹽、EDTA等螯合劑以除DNase必需的Mg2+離子,使DNase活性降低,并要求整個分離制備的過程均在4℃以下進(jìn)行,以減少DNase的降解作用,zui后加入SDS使所有的蛋白質(zhì)(包括DNase)變性。當(dāng)然如果希望獲得更大分子的DNA時,則在細(xì)胞破碎后,及時加入SDS使蛋白質(zhì)(包括DNase)變性,并加入蛋白酶K,降解所有的蛋白質(zhì)成為碎片或氨基酸,及時阻止DNase的降解作用。
DNA分子很大、很長,在水中呈黏稠狀,但DNA鏈的雙螺旋結(jié)構(gòu)不宜小角度的折疊,使之DNA分子具有剛性,即分子是僵直的(stiff),小角度的折疊和壓擠等剪切力,將使DNA斷裂成碎片。為保證獲得大分子DNA,操作時應(yīng)避免急裂振搖,或過大的離心力。轉(zhuǎn)移吸取DNA時不可用過細(xì)的吸頭,不可猛吸猛放,更不能用細(xì)的吸頭反復(fù)吹吸。