酶標記抗體法染色的基本原理
酶標記抗體法和熒光素標記抗體法的原理類似,分為直接法和間接法,其原理基本相同,但敏感性不同。
(一)直接法
直接法是將酶(如HRP)標記在特異性抗體(*抗體)上,然后用酶標記抗體直接與相應原特異性結(jié)合,形成抗原—抗體—HRP復合物,zui后用酶底物DAB-H202顯色。該法的優(yōu)點是簡單、步驟少,省時、特異性高、非特異性染色輕:缺點是敏感性差,因為一個抗原決定簇只結(jié)合一個HRP分子(假設(shè)一個抗體分子與一個HRP分子結(jié)合)。另外,一種標記抗體也只能檢測一種抗原。若要檢測多種抗原,就必須標記每一種特異抗體,這樣既麻煩又不經(jīng)濟。目前此法很少應用,但在單克隆抗體制備過程中,為了更特異地篩選單抗,仍常用此法。
(二)間接法
間接法也稱夾心法,是直接法的簡單改進,將酶示蹤物標記在二抗上,再與*抗體(已與相應抗原反應形成復合物的IgG)反應,然后進行顯色反應。此法要求第二抗體與特異性抗體(一抗)應是不同種屬的動物產(chǎn)生,如特異性抗體(一抗)是兔抗人IgG,酶標記抗體(二抗)則可以是羊抗兔抗體。該法與直接法比較有以下優(yōu)點:
①應用面較寬,僅標記一種二抗就可以檢測眾多相同的*抗體,例如眾多一抗為兔來源,只要標記一種抗兔二抗就可用于所有抗兔一抗的檢測,不需要對每種特異性抗體進行標記;
②敏感性增加,*抗體的工作濃度在直接法的基礎(chǔ)上進一步稀釋;
③可以商品化購置;
④可以設(shè)計各種對照。
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