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遠慕生物:用ELISA法可檢測幽門螺桿菌的抗體
點擊次數(shù):948 更新時間:2016-10-08

    用ELISA法可檢測幽門螺桿菌的抗體


    1 材料和方法


    1.1 材料


    ①40孔聚苯乙烯微量凹孔板:②酶聯(lián)板離心籃:根據(jù)40孔酶聯(lián)板本實驗室自行設(shè)計制成。③DG—Ⅰ型酶聯(lián)免疫檢測儀:④試劑:過氧化物酶(HRP),R2=3.2,美國Sigma公司產(chǎn)品。鄰苯二胺(OPD):按文獻配制。包被液:取碳酸鈉1.59g加碳酸氫鈉2.93g,蒸餾水1000ml配成。洗滌液:以上未加吐溫—20的洗滌液100ml+2%小牛血清+4%聚乙二醇(PEG)。封板液:5%小牛血清。戊二醛固定液:25%戊二醛液,100ml裝,Kochligh進口分裝,用時稀釋成0.25%戊二醛固定液。終止液:2NH2SO4。⑤抗原的制備:將澳大利亞*佩思醫(yī)院的Hp標準菌株(NCTC11638)及從胃鏡檢查患者胃粘膜活檢標本分離出的Hp菌株分別接種于心腦血平板,37℃培養(yǎng)5d后取菌落作生化與血清學(xué)鑒定(自制兔抗Hp抗體),然后取單個菌落移種于另一血平板,繼續(xù)培養(yǎng)3d,經(jīng)鑒定后將其大量增殖培養(yǎng),3d后將菌苔刮下,置生理鹽水中制成菌液,加福爾馬林固定(0.1%~0.3%),4℃過夜,3000r/nin離心30min,沉淀3次,將zui后1次沉淀懸于少量PBS液內(nèi),用比濁管沒出細菌濃度,制成含菌3×109ml,置冰箱冰凍,反復(fù)凍融3次,經(jīng)顯微鏡檢查無菌體存在后,制成可溶性抗原,采用Lowry氏法蛋白定量,-20℃保存?zhèn)溆?。⑥臨床血清標本:采自胃鏡檢查患者,隨機采取1988年8~10月胃鏡檢查病人共38人,抽靜脈血2ml,分離血清貯存-20℃?zhèn)溆?。⑦陰性對照血清,進行ELISA測定,取其平均OD值作對照。⑧酶標羊抗人IgG結(jié)合物(SAHIgG—HRP)的制備:按過碘酸鹽改良法,略加改進標記制成酶標抗體。即HRP8.0ml,22℃較攪20min。加乙二醇6滴,繼續(xù)攪拌5min,對pH4.2,0.001mol/L醋酸鹽緩沖液(用2molHC1調(diào)pH)透析過夜,中間換水4次,加羊抗人IgG14mg,逐滴加pH,1.0mol碳酸鹽緩沖液,使pH升到9.0~9.5,室溫較攪2h,加硼氫化鈉(4mg/ml)0.2ml,置4℃2h,對pH7.2,0.01molPB-0.4molNaCl緩沖液在4℃透析平衡。換水4次,收取透析袋內(nèi)結(jié)合物,以50%飽和度硫酸銨溶液鹽析去除游離酶后,測定精制結(jié)合物,E/P克分子比值合格后,將結(jié)合物小瓶分裝置-20℃保存,備用。⑨尿素酶測定法和Hp的分離培養(yǎng)法參考文獻進行。


    1.2 方法


    并稍加改進,即:抗原包被微量滴定板:用包被液將抗原按2×108億/ml(含蛋白8.6μg)稀釋后,每孔加100μ,離心籃離心20min2000r/min后,倒去孔內(nèi)液體,然后加入0.25%戊二醛液50μl/孔,4℃固定30min,倒去戊二醛,用洗滌液洗3次(每次3min),加5%小牛血清液,200ml/孔,經(jīng)37℃30min封板后倒去孔內(nèi)液體。每孔加待檢血清(1:100稀釋)100ml,37℃保溫1h后,如上洗滌3次,同時做陰性對照孔和空白孔。之后于各孔內(nèi)加和新鮮稀釋的酶標羊抗人IgG結(jié)合物100ml,37℃保溫半小時,于各孔中加入2NH2SO450μl終止反應(yīng)后,于酶聯(lián)測定儀以波長490nm測定OD值,將測得標本OD值(P)與陰性對照OD值(N)比(P/N),若P/N比大于或等于2.0為陽性。

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