細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則和原理

細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實驗證明這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力。如今細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細(xì)胞造成損傷。

細(xì)胞凍存的基本步驟

（一）細(xì)胞凍存

1.配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液；

2.取對數(shù)生長期的細(xì)胞，去除舊培養(yǎng)液，用PBS清洗。

3.去除PBS，加入適量胰i蛋白酶（覆蓋培養(yǎng)皿表面）把單層生長的細(xì)胞消化下來；

4.離心1000rpm，5min；

5.去除胰i蛋白酶，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的最終密度為5×106/ml～1×107/ml；

6.將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管1～1.5 ml；

7.在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時間及操作者；

8.凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序為降溫速率-1～-2℃/min；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時，可增至-5℃～-10℃/min；到-100℃時，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。

（二）細(xì)胞復(fù)蘇

1.從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時搖動令其盡快融化。

2.從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻；

3.離心，1000rpm，5min；

4.棄去上清液，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；

5.次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。