革蘭氏陰性菌,如大腸桿菌（E. coli）和假單胞菌(Pseudomonads)等的細(xì)胞壁成分被認(rèn)為是內(nèi)毒素。它們具有一個親水性多糖和親脂性脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，有別于它們所源自的細(xì)菌,具有高度的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。內(nèi)毒素屬于致熱源，如果它們與粘膜發(fā)生接觸或者一旦它們進(jìn)入血液循環(huán)，便會導(dǎo)致發(fā)熱（參考文獻(xiàn)詳見Steck, 20061）。
根據(jù)通用的藥典，在藥物的生產(chǎn)工藝中內(nèi)毒素含量不可超出所規(guī)定的限值。
在生物制藥（如：免疫球蛋白）生產(chǎn)所需的哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)中，內(nèi)毒素的出現(xiàn)可能會導(dǎo)致死亡。因此，在生物制藥生產(chǎn)、細(xì)胞系傳代，或者細(xì)胞培養(yǎng)過程中需要使用超純培養(yǎng)基，當(dāng)然也相應(yīng)的需要超純水，它們所含有的內(nèi)毒素含量水平已獲證明低于所規(guī)定的限值。
本研究的目的在于展示Arium pro VF系統(tǒng)產(chǎn)生的超純水所具有的內(nèi)毒素含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于規(guī)定的限值，因而可用于上述各種應(yīng)用。
實(shí)驗(yàn)方法
為了對Arium pro VF系統(tǒng)所生產(chǎn)的超純水中的內(nèi)毒素含量進(jìn)行檢測，我們分別采用了凝膠法和顯色法來測試。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果
在0.001 EU/ml-0.05 EU/ml的濃度范圍內(nèi)，凝膠法顯示的是陰性結(jié)果，意即無凝膠形成（無內(nèi)毒素檢測到；見表1）；當(dāng)濃度≥0.1 EU/ml時發(fā)生了凝集反應(yīng)。該結(jié)果顯示了在凝膠法的檢測敏感限值內(nèi)，在Arium pro VF系統(tǒng)所生產(chǎn)的超純水中未出現(xiàn)內(nèi)毒素。
顯色法中，在405nm波長處的60吸附讀數(shù)（見下圖）根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)樣品中內(nèi)毒素含量的不同生成了不同斜率的曲線。達(dá)到吸收率所需要的時間通過特殊的計算機(jī)程序進(jìn)行計算，并將之用為推斷具有未知內(nèi)毒素含量的樣品的依據(jù)（具體的值詳見表1-顯色測試）。由于具有最di低濃度（0.005-0.001 EU/ml）的標(biāo)準(zhǔn)樣品和Arium水未達(dá)到所需的計算內(nèi)毒素含量的消光值，因此它們被認(rèn)定為低于檢測限值。
Arium pro VF超純水所獲得的值明顯比0.001 EU/ml曲線的繪制點(diǎn)更加低。下圖顯示了與兩個選定的內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)（0.05 EU/ml and 0.005 EU/ml）相比，在自來水、去離子水（DI水）和Arium水中所測得的內(nèi)毒素濃度的數(shù)據(jù)集合。在水樣品中的內(nèi)毒素含量通過使用內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)所測得的值來計算，詳見表2.
在DI水樣品中，檢測到內(nèi)毒素為0.02 EU/ml，這個值低于WFI（注射用水）現(xiàn)行的有效值。在自來水中，出乎意料地檢測到高達(dá)25 EU/ml的內(nèi)毒素載量。該結(jié)果未作進(jìn)一步分析。與之相對，在系統(tǒng)所產(chǎn)生的超純水中所檢測到意料之外的低值，< 0.001 EU/ml，這個值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于常見的限值。
在DI水樣品中，檢測到內(nèi)毒素為0.02 EU/ml，這個值低于WFI（注射用水）現(xiàn)行的有效值。在自來水中，出乎意料地檢測到高達(dá)25 EU/ml的內(nèi)毒素載量。該結(jié)果未作進(jìn)一步分析。與之相對，在系統(tǒng)所產(chǎn)生的超純水中所檢測到意料之外的低值，< 0.001 EU/ml，這個值遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于常見的限值。
結(jié)論
測試結(jié)果顯示了Arium pro VF系統(tǒng)生產(chǎn)的超純水可作為一種方便、實(shí)惠的選擇，用于內(nèi)毒素測試的樣品制備，因?yàn)樵谄渌a(chǎn)的超純水中檢測到的內(nèi)毒素濃度非常低（<0.001 EU/ml）。得到的結(jié)果也證實(shí)了早期關(guān)于在Arium超純水中發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素載量<0.001 EU/ml的試驗(yàn)。
在此超純水中的內(nèi)毒素濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于美國藥典所規(guī)定的限值，這也使得該超純水理論上適用于制藥產(chǎn)品的生產(chǎn)/內(nèi)毒素監(jiān)測方面。相關(guān)的例子包括產(chǎn)品制劑，透析過濾解決方案，層析緩沖液以及用于萃取、清洗、無菌步驟和細(xì)胞培養(yǎng)方案的水等。
在細(xì)胞培養(yǎng)應(yīng)用范圍內(nèi)，我們需要在工藝的各個步驟都對污染物保持高度警惕。為了對內(nèi)毒素對細(xì)胞培養(yǎng)物及細(xì)胞敏感度的影響保持可控，尤其是與此類內(nèi)毒素相關(guān)時，用于細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基都必須要明確不含可檢測到的內(nèi)毒素含量（見參考文獻(xiàn)5）。
參考文獻(xiàn)/更多信息
1 Steck, S. : Endotoxine und ihre Bedeutung bei R & D Applikationen. Bioforum 6/2006.
2 Endosafe® -PTS™ Glucan Assay, Charles River Laboratories International, Inc, 2009.
3 Endotoxin Compendium, V 2.11, Hyglos GmbH, Bernried, Germany.
4 Untersuchungsbericht Fresenius Medical Care, Deutschland GmbH, Werk St. Wendel, 2007.
5 Dawson, M.E. : LAL Update von Associates of Cape CodIncorporated, March 1998, Vol. 16, No. 1. Adapted from the original German article by Dr. Herbig, June 7, 2012
