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遠慕分享:酶標記抗體的方法步驟
點擊次數(shù):320 更新時間:2023-11-28

  1、HRP標記抗體的方法

  酶與抗體交聯(lián)的方法有許多種,根據(jù)酶的結構不同可采用不同的方法。對于制備HRP結合物,可用戊二醛二步法和過碘酸鈉法。尤以簡易過碘酸鈉法更為常用。

  戊二醛二步法

  原理

  戊二醛為一種雙功能試劑,通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價結合,形成酶-戊二醛-免疫球蛋白結合物。

  2、標記步驟

  (1)稱取HRP25mg溶于1.25%戊二醛溶液中,于室溫靜置過夜。

  (2)反應后的酶溶液經(jīng)Sephadex G-25層析柱,用生理鹽水洗脫。流速控制在1ml/1分鐘,收集棕色流出液。如體積大于5ml,則以PEG濃縮至5ml。放置25ml小燒杯中,緩慢攪拌。

  (3)將待標記的抗體12.5mg用生理鹽水稀釋至5ml,攪拌下逐滴加入酶溶液中。

  (4)用1M PH9.5碳酸緩沖液0.25ml,繼續(xù)攪拌3?小時。

  (5)加0.2M賴氨酸0.25ml,混勻后,置室溫2小時。

  (6)在攪拌下逐滴加入等體積飽和硫酸銨,置4℃1小時。

  (7)3000rpm離心半小時,棄上清。沉淀物用半飽和硫酸銨洗二次,最后沉淀物溶于少量0.15M PH7.4的PBS中。

  (8)將上述溶液裝入透析袋中,對0.15M PH7.4的PB緩沖鹽水透析,去除銨離子后(用萘氏試劑檢測),10,000rpm離心30分鐘去除沉淀,上清液即為酶結合物,分裝后,冰凍保存。

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