質(zhì)粒提取主要有堿裂解法,煮沸裂解法,小量一步提取法等。
1、堿裂解法原理:根據(jù)共價閉合環(huán)狀DNA與線性DNA的拓撲學
結(jié)構(gòu)差異來分離的。在強堿環(huán)境下,細菌的細胞壁和細胞膜被破壞,基因組DNA和質(zhì)粒DNA被釋放出來,線性DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)被破壞而發(fā)生變性。雖然在強堿的條件下共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA也會發(fā)生變性,但兩條互補鏈仍會互相盤繞,并緊密的結(jié)合在一起。當加入pH4.8的乙醋suan鉀高鹽緩沖液使pH恢復中性時,共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA復性快,而線性的染色體DNA復性緩慢,細菌蛋白質(zhì)、破裂的細胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復合物,后者被十二烷基硫酸鹽包蓋。當用鉀離子取代鈉離子時,復合物會從溶液中有效地沉淀下來,離心除去變性劑后,就可以從上清中回收復性的質(zhì)粒DNA。
2、煮沸法裂解:將細菌懸浮于含Triton X-100
和能消化細胞壁的溶jun酶緩沖液中,然后加熱到100℃使其裂解。加熱除了破壞細胞壁外,還有助于解開DNA鏈的堿基配對,并使蛋白質(zhì)和染色體DNA變性。但是,閉環(huán)質(zhì)粒DNA彼此不會分離,這是因為他們的磷酸二酯骨架具有互相纏繞的拓撲結(jié)構(gòu),當溫度下降后,閉環(huán)DNA的堿基又各自就位,形成超螺旋分子,離心除去變性的染色體核蛋白質(zhì),就可從上清中回收質(zhì)粒DNA。
煮沸裂解法
對于小于15kb的小質(zhì)粒很有效,可用于提取步至lmL(小量制備),多至250mL(大量制備)菌液的質(zhì)粒,并且對大多數(shù)的大腸桿菌菌株都適用。
3、小量一步提取法:由于細菌染色體DNA
比質(zhì)粒大得多,受機械力后細菌染色體DNA會被震斷成不同大小的線性片段而纏繞附著在細胞碎片上,并發(fā)生變性。同樣受機械力質(zhì)粒DNA會變性,機械力消失后復性。但質(zhì)粒DNA的復性快,仍溶于溶液而細菌染色體DNA復性較慢,會形成不溶的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),通過高速離心可以分離得到質(zhì)粒DNA 。