瓊脂糖凝膠電泳儀是以瓊脂糖凝膠作為載體的電泳,廣泛用于核酸研究。瓊脂糖凝膠屬于大孔膠,可分析分子量為107的大分子,這種大孔特性有利于免疫電泳和微量制備。
瓊脂糖形成凝膠后孔徑的大小取決于瓊脂糖凝膠濃度,瓊脂糖凝膠濃度與平均孔徑的關(guān)系如下:
一、瓊脂糖凝膠濃度為0.075%時(shí),平均孔徑為800nm。
二、瓊脂糖凝膠濃度為0.16%時(shí),平均孔徑為500nm。
三、瓊脂糖凝膠濃度為1%時(shí),平均孔徑為150nm。
四、瓊脂糖凝膠濃度為2%時(shí),平均孔徑為20nm。
瓊脂糖凝膠的濃度選擇:
目的產(chǎn)物大小80BP的片段,你可以用2.0%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,瓊脂糖以及TAE的量的多少,首先與你跑得樣品的個(gè)數(shù)有關(guān),因?yàn)槟銟悠返膫€(gè)數(shù)決定了你膠槽的體積,膠槽的體積決定了你的TAE的量,決定了瓊脂糖的量,比如說(shuō)你膠槽的體積是20ml, 那么你要配2.0%的膠,就需要20ml的TAE和0.4g的瓊脂糖。
做膠的時(shí)候要注意一定要讓瓊脂糖充分溶解,可以煮沸,同時(shí)也要注意煮沸的過(guò)程中TAE的蒸發(fā),我第一次做膠的時(shí)候,用燒瓶煮沸差點(diǎn)都蒸發(fā)光了;再就是加EB的時(shí)候以不燙手為標(biāo)準(zhǔn),因?yàn)楦哂?0度時(shí)EB會(huì)升華蒸發(fā),過(guò)于冷卻了會(huì)使EB的濃度不均;因?yàn)镋B為致癌物質(zhì),所以操作時(shí)一定要注意做好自我保護(hù);再就是膠槽要洗干凈,梳齒一定要放正,免得跑出來(lái)的帶不整齊。
跑膠的時(shí)間和電壓成反比,電壓和電泳槽兩個(gè)電極之間的距離成正比,一般是小于5V/cm. 因?yàn)槟愕钠魏苄?,所以很有可能和引物二聚體無(wú)法區(qū)分,所以你再跑電泳時(shí)時(shí)間應(yīng)該適當(dāng)延長(zhǎng)一些,可以使溴芬蘭指示條帶跑過(guò)膠的2/3處,因?yàn)闀r(shí)間長(zhǎng)了,因物二聚體就會(huì)跑沒(méi)了,而目的產(chǎn)物不會(huì)。