聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）是一種用于放大擴增特定的 DNA 片段的分子生物學技術(shù)，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制，PCR的最大特點是能將微量的 DNA 大幅增加。
 
我們進行核酸擴增時，經(jīng)常會不定的出現(xiàn)一些異常問題，那么遇到這些問題該怎么解決呢？接下來跟著遠慕一起來看看前輩們的經(jīng)驗。  
 
沒有 ct 值
檢測結(jié)果遇到?jīng)]有 Ct 值情況,排查是否有以下問題:  
1.循環(huán)數(shù)不夠  (一般不超過 45 循環(huán)，不僅背景值提高,定量也不準);  
2.PCR 程序設(shè)置錯誤,檢測熒光信號的步驟有誤。一般 SG 法采用 72 ℃ 延伸時采集，TaqMan 法則一般在退火結(jié)束時或延伸時采集信號，另外熒光采集是否選中。  
3.引物或探針降解?？赏ㄟ^ PAGE 電泳檢測引物和探針是否降解;  
4.模板量可能降解或上樣量不足  (不超過 5 ng，根據(jù)試劑盒說明書即可), 對未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解，應(yīng)考慮樣本準備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況，建議將模板樣本小量分裝儲備，避免反復(fù)凍融;  
5.引物探針是否合適  (尤其是引物跨越內(nèi)含子，以確保擴增基因組DNA；上下游引物 Tm 值超過 4 ℃ 以上也會影響擴增)。  
 
ct 值過晚
在相對定量中, Ct 值一般控制在 15 ~ 25 之間比較好，如果在絕對定量中, 對低拷貝數(shù)的樣品，Ct 值會增大, 但是一般不宜超過 4 循環(huán), 否則定量不準確。. 因此，判斷 Ct 值出現(xiàn)過晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實驗設(shè)計和目的進行。  
1.擴增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進行優(yōu)化；引物或探針設(shè)計不合理，需要重新設(shè)計；  
2.PCR 程序不合適  , 改用三步法進行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當降低退火溫度；退火/延伸時間短(可以在推薦的時間條件下延長1s)；  
3.MgCl2 濃度不合適  ，增加鎂離子濃度等。PCR 各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足；  
4.PCR 產(chǎn)物太長。PCR 產(chǎn)物設(shè)計超過 5 bp；  
5.模板中存在抑制物。用高純度模板進行 PCR 檢測或?qū)⒛０暹M行稀釋。
 
陰性對照擴增有信號
陰性對照擴增有信號排查各操作環(huán)節(jié)是否有不當,造成交叉污染:
1.引物設(shè)計不夠優(yōu)化。應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。  
2.引物濃度不佳。適當降低引物濃度，并注意上下游引物的濃度配比。  
3.鎂離子濃度過高。適當降低鎂離子濃度,或選擇更適合的 mix 試劑盒。  
4.模板有基因組的污染。RNA 提取過程中避免基因組 DNA 的引入,或通過引物設(shè)計避免非特異性擴增。  
5.交叉污染。在所用的試劑中有交叉污染, 或操作環(huán)境中有氣溶膠造成污染, 建議對操作環(huán)境進行處理, 或者更換新的環(huán)境、加樣器、槍頭以及所有的引物、試劑等。
 
標準曲線不佳
標準曲線線性關(guān)系不佳 R2 < .9，很有可能是以下環(huán)節(jié)存在問題:
1.標準品稀釋或者加樣誤差  ,使得標準品不呈梯度。
2.標準品出現(xiàn)降解。應(yīng)避免標準品反復(fù)凍融,將高濃度 DNA 模板分裝,保存于 -2 ℃ 或 -8 ℃，現(xiàn)配現(xiàn)用。  
3.引物或探針不佳。重新設(shè)計更好更穩(wěn)定的引物或探針。  
4.模板中存在抑制物。模板濃度過高,根據(jù)現(xiàn)有商品化熒光定量試劑盒的要求，一般模板量以 5 ~ 5 ng 為宜。
 
熔解曲線峰不特異
熔解曲線峰不特異很有可能是以下環(huán)節(jié)存在問題:
1.引物設(shè)計不夠優(yōu)化。應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)；引物濃度不佳, 尤其是涉及二聚體存在時, 適當降低引物濃度, 并注意上下游引物的濃度比例;  
2.模板有基因組污染。RNA 提取過程中避免基因組 DNA 的引入, 或通過引物設(shè)計避免非特異性擴增。  
3.離子濃度不合適。適當降低鎂離子濃度, 或選擇更適合的 mix 試劑盒, 不同試劑盒在該方面的優(yōu)化能力不適合, 有些情況下可以通過更換試劑盒改善結(jié)果。
 
擴增曲線異常
遇到擴增曲線異常，比如 S 型曲線等等情況,有可能是以下環(huán)節(jié)存在問題：
1.模板的濃度太高或者降解。
2.熒光染料的降解。  
3.人為污染。在操作熒光定量 PCR 時，帶上新的一次性手套,蓋上避免任何指紋或者字跡等。  
4.液體揮發(fā)。耗材氣密性等問題引起液體蒸發(fā),沒有很好的聚集在管子里;  
5.氣泡。操作問題如移液槍加樣引起的氣泡問題。
 
擴增效率低
該情況適用于針對所有的基因,特別是內(nèi)參基因仍無法獲得較好的擴增信號時,應(yīng)考慮如下情況:
1.反應(yīng)試劑中部分成分比例是否最佳，另外考慮熒光染料是否降解。  
2.反應(yīng)條件不夠優(yōu)化。可適當降低退火溫度或改為三步擴增法,適當延長變性退火時間。  
3.反應(yīng)體系中有 PCR 反應(yīng)抑制物。一般是加入模板時所引入的,應(yīng)先把模板適度稀釋，再加入反應(yīng)體系，減少抑制物的影響。
 
其他原因
模板反復(fù)凍融、模板長時間在紫外光下照射導(dǎo)致的模板發(fā)生突變；基因序列與 NCBI 上的不一致。
 
今天的講解就到這里啦，關(guān)于PCR的這些小陷阱你了解了嗎？如果有其他實驗相關(guān)的問題也可以咨詢我們遠慕生物技術(shù)人員哦~